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半定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)步驟介紹
點(diǎn)擊次數(shù)：1115 更新時(shí)間：2023-02-10
半定量RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)步驟：
Trizol法RNA提取步驟
1、提取總RNA
2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
3、PCR反應(yīng)
以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考：
1樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其溶解。
②兩相分離
每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀
將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm
離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗
移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀
溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
